Cat. #:P8011,P8012
产品概况
本试剂盒利用PCR原理,结合本企业的快速DNA聚合酶(延伸速率20s/kb),设计适用性广的最佳引物,优化PCR反应缓冲体系,同时简化检测方法,可用于各种常用T载体克隆的筛选检测。
产品组成
Component | P8011 | P8012 |
2× FSTM Mix | 500 μl | 1 ml × 5 |
T-primer (10 μM) | 50 μl | 500 μl |
超纯水 | 1 ml | 1 ml × 10 |
说明书 | 1份 | 1份 |
活性定义
一个活性单位(U)指用活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物,在72℃、30 min内,摄入10 nmol全核苷酸所需的酶量。
保存条件
-20℃保存。
质量控制
纯度检测:经质量检测,产品不含脱氧核糖核酸内切酶、脱氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶污染。
功能检测:PCR方法检测本试剂盒无宿主残余DNA,也无其他DNA污染,能有效完成PCR扩增。
应用举例
1. 准备样品
将过夜培养的平板上的菌落编号后,用灭菌的牙签挑取单克隆菌体的一部分至反应体系中;或在1.5 ml EP管中分装500 μl含有相应抗生素的LB培养基,并做好标记,用无菌牙签提取单个菌落至上述培养基中,37振荡(250-300rpm)培养4h,取1-2 μl菌液用于扩增。
2. 配制反应体系
请于冰上配置反应体系,体系大小与组分用量与添加顺序可调整:
Ordinal | Component | Volume (20 μl reaction volume) |
1 | 2× FSTM Mix | 10 μl |
2 | T-primer (10 μM)* | 1 μl |
3 | 菌体或菌液 | 1 μl |
4 | 超纯水 | To 20 μl |
*包含了上下游引物,扩增大小约为:克隆片段+250 bp。
● 加入各组分后,请用枪头反复吸吹几次,充分混匀。
● 在一次配制多管需分装时建议按(n+1)的反应液量配制,以确保分配时的耗损不会影响实验,同时选择大于总体积的离心管便于混匀。
● 如需使用其他体积的PCR反应体系,请按各组分比例缩减或增加各组分用量。
● 将混匀的各管短暂离心,置于PCR仪中。
3. 设定反应程序进行PCR反应
Stage | Temperature | Time | Number of Cycles |
Initial Denaturation | 94℃ | 3 min | 1 |
Denaturation | 94℃ | 30 sec | 30 |
Annealing | 55℃ | 30 sec | |
Extension | 72℃ | 30 sec or 45 sec | |
Final Extension | 72℃ | 5 min | 1 |
● 设定PCR程序时,请根据目的片段大小决定延伸时间,如果目的片段大小为500 bp时,延伸时间为15 sec;500 bp-1 kb,延伸时间20 sec;目的片段>1 kb时,延伸时间按20s/kb计算。
3. 分析结果
反应结束后取2-5 μl反应产物与loading buffer混匀后进行琼脂糖凝胶电泳,通过凝胶成像设备观察目的条带的扩增情况。
注意事项
请严格按照说明书提供的实验体系及实验条件进行试验。
室温下DNA聚合酶有一定的活性,为避免发生非特异性扩增,请于冰上配置反应体系,并且最后添加FSTM Mix或模板DNA。
挑取菌落时,应选择单菌落,不要挑取太多菌体,以免影响PCR结果。
部分适用T载体参考下表:
企业 | T载体 |
Promega | pGEM-T Vector |
pGEM-T Easy Vector | |
Takara | pMD18-T Vector |
pMD19-T Vector | |
pMD20-T Vector | |
pMD18-T Simple Vector | |
pMD19-T Simple Vector | |
pSIMPLE-18 EcoR V/BAP Vector | |
pSIMPLE-19 EcoR V/BAP Vector | |
Tiangen | pGM-T载体 |
pBS-T载体 |