实验方案分享:多克隆疟原虫株系中特定单倍型药物反应表型的剖析

栏目:技术分享 发布时间:2024-07-01

Multiplex Probe qPCR Mix Plus U 实验方案 1

 

多克隆疟原虫株系中特定单倍型药物反应表型的剖析:

 

1. 实验材料和试剂准备

- 选择3个疑似多克隆的P. falciparum株系,例如IPC_3445 (MRA-1236), IPC_5202 (MRA-1240), IPC_6403 (MRA-1285)

- 准备O+型人类红细胞和RPMI 1640培养基,以及所需的补充剂和抗生素。

- 准备氯喹、甲氟喹和哌拉喹药物储备溶液。

- 准备用于DNA提取、基因分型和PCR反应的相关试剂。

 

2. 疟原虫株系的体外培养

- 使用标准体外培养条件,将疟原虫株系在37°C5% CO290% N2气氛下培养。

 

3. 多克隆性质的确认

- 提取每个疟原虫株系的DNA,并在24个高度多态性SNP位点进行基因分型。

 

4. 单一寄生虫谱系的分离

- 通过限制稀释法,将疟原虫株系在96孔板中进行稀释,以分离单个受感染的红细胞。

- 使用SYBR? Green I荧光染料检测寄生虫DNA,确定阳性孔。

 

5. 基因分型和系统发育分析

- 对每个阳性孔中的寄生虫进行基因分型,使用24-SNP分子条形码法。

- 构建系统发育树,分析不同寄生虫谱系之间的关系。

 

6. 体外抗疟药敏感性测试

- 使用SYBR? Green Antimalarial Assay对氯喹、甲氟喹和哌拉喹的敏感性进行测试。

- 测定每种药物的半最大抑制浓度(IC50)。

 

7. 寄生虫存活试验

- 对于CQPPQ,使用环阶段存活试验(RSA)和哌拉喹存活试验(PSA)来确定寄生虫对药物的存活率。

 

8. 抗疟药抗性位点的测序和基因分型

 

8.1 目标基因的选择

选择已知与抗疟药抗性相关的基因,包括但不限于:

- 氯喹抗性相关基因:pfcrt(疟原虫氯喹抗性转运蛋白)

- 甲氟喹和哌拉喹抗性相关基因:pfmdr-1(疟原虫多药耐药1基因)

- 蒿甲醚抗性相关基因:K13基因

 

8.2 DNA提取和PCR扩增

- 使用DNA提取试剂盒从疟原虫培养物中提取基因组DNA

- 设计特异性引物,针对上述基因进行PCR扩增。例如,使用五组引物覆盖整个pfcrt基因。

 

8.3 SNPs检测

- 使用Sanger测序技术对PCR产物进行测序,以检测pfcrtpfmdr-1K13基因中的单核苷酸多态性(SNPs)。

- 利用测序结果分析App(如DNASTAR Lasergene)进行序列数据的分析和可视化。

 

8.4 拷贝数变异检测

- 使用ΔΔCT方法确定pfmdr-1pfmp-2(疟原虫血浆膜蛋白2基因)的拷贝数,这些基因与甲氟喹和哌拉喹抗性相关。

- 通过实时定量PCRqPCR)技术,在同一孔中同时扩增目标基因和内参基因(如β-微管蛋白基因或丝氨酸tRNA连接酶基因)。

 

8.5 qPCR实验操作

- 准备主混合液,包含Multiplex Probe qPCR Mix Plus U GDSBio, P2701、无菌水、目标基因和内参基因的预配方Taqman SNP检测。

- 将主混合液分配到96PCR板中,每个样本包含75 ng的寄生虫DNA

- 使用CFX96实时PCR仪器进行样品扩增,并使用基因表达模块分析结果。

 

8.6 数据分析

- 将目标基因的拷贝数与内参基因的拷贝数进行比较,以确定相对拷贝数。

- 使用已知拷贝数的标准样品(如3D7株系)进行校准。

- 对于pfmdr-1pfmp-2基因,分析是否存在基因扩增现象,这可能与抗药性发展有关。

 

8.7 结果记录和说明

- 记录所有测序和qPCR结果,包括基因型和拷贝数。

- 说明测序和拷贝数变异数据,分析它们与体外抗药性表型之间的潜在联系。

 

8.8 质量控制

- 包括使用已知基因型的实验室控制株系作为阳性和阴性对照。

- 对每个实验步骤进行重复,以确保数据的准确性和可重复性。

 

以上步骤提供了详细的实验流程,用于检测和分析与抗疟药抗性相关的基因变异。实验操作应严格遵守实验室规程和生物安全指南,确保数据的准确性和可靠性。

 

9. 数据分析

- 使用GraphPad PrismApp分析IC50值和存活率数据。

- 应用统计方法比较不同寄生虫谱系之间的差异。

 

10. 结果说明和报告

- 说明实验结果,讨论不同寄生虫谱系的抗药性表型。

- 撰写实验报告,包括实验方法、结果和讨论。

 

11. 安全性和质量控制

- 确保实验操作符合生物安全标准。

- 使用已知的实验室控制株系作为阳性和阴性对照。

 

12. 实验材料的保存和记录

- 记录所有实验步骤和结果。

- 保存所有原始数据和实验材料,以备后续分析和验证。

 

这个实验方案提供了一个全面的框架,用于研究P. falciparum株系的多克隆性和抗药性表型。实验操作应严格遵守实验室规程和生物安全指南。

 

Multiplex Probe qPCR Mix Plus U 

货号:P2701P2702P2703P2704 

产品概况 

Multiplex Probe qPCR Mix Plus U 是用于探针法实时定量 PCR 的 2×浓缩预混液,使用时 只需加入模板、引物和探针即可进行反应。本品含有抗体技术修饰的热启动酶 Hotstart Taq DNA 聚合酶,配合东盛特制的 Real Time PCR Buffer,不仅有效抑制引物二聚体和其他非 特异性扩增,而且能够提高扩增效率,可以进行多重探针 qPCR 反应。该试剂引入 了 dUTP/UDG 防污染系统,可以在 PCR 反应前清除含 dUTP 的 PCR 产物,有效避免因 扩增产物的交叉污染对定量的影响。本品方便用于制备 IVD 分子诊断试剂盒,对靶基因定 量准确、可信度高,重复性好。本品可搭配 TaqMan 等各类荧光探针使用,与常见定量 PCR 仪完美兼容,如 ABIRocheBio-Rad 等。 

产品用途

探针法基因表达分析

多重低拷贝基因检测

产品特点

可进行多重探针法荧光定量PCR

适合常见定量机型

高效热启动技术带来高特异和可重复的扩增

 dUTP/UDG 防污染系统

稳定性高,适合大规模检测